В 1740 году прихожане соборной Андреевской церкви, в то время ещё деревянной и неотапливаемой, обстоятельно описав неудобства проведения богослужений в холодное время года, обратились к императрице Анне Иоанновне с просьбой о разрешении построить рядом с церковью, на её участке, тёплый каменный храм. Последовал Высочайший указ по которому 2 июля 1740 года и был заложен храм во имя Трёх Святителей Вселенских Василия Великого, Григоря Богослова и Иоанна Златоуста.
Начавшееся по проекту Карло-Джузеппе Трезини строительство из-за недостаточности средств затянулось. В 1743 году по челобитью священника Андреевской церкви Иакова Тихонова императрица Елизавета Петровна издала указ Сенату о том, что бы денег за материалы на строительство нового храма с прихода не требовать, т.к. при Андреевской церкви не имелось вкладных сумм.
В 1745 году церковь была построена, и в ней начались богослужения. Освящена Трёхсвятительская церковь с Благовещенским приделом на хорах лишь 17 сентября 1760 года. Иконостас и церковную утварь перенесли из сгоревшего Андреевского собора, в который она была передана из домовой Благовещенской церкви Меншиковского дворца.
В 1761-1780 гг. во время строительства нового здания собора андреевский причт совершал богослужения в Трёхсвятительском храме.
В 1845 году в церковной жизни храма произошли большие изменения. Указом Святейшего Синода от 3 апреля 1845 года приходская Благовещенская церковь на углу 7-й линии и Малого проспекта передана под Новодевичий монастырь, а благовещенскому причту для совершения богослужений отдана Трёхсвятительская. Так было до 1 июня 1854 года, когда Благовещенская церковь вновь была возвращена прежним прихожанам.
19 ноября 1916 года храм Трёх Святителей временно, до постройки своей церкви, передан грузинскому православному приходу, который в марте 1918 года из-за революционных событий и отъезда прихожан закрылся.
По мнению известного искусствоведа академика И.Э.Грабаря Трёхсвятительская церковь обладала к началу XX века одним из самых значительных в С.-Петербурге собранием древнерусских икон.
Со средины 20-х годов богослужения в церкви не совершались. В 1929 году хранившийся в храме архив Андреевского собора вывезен, часть икон и царские врата переданы в Русский музей, а церковная утварь и металлическая решётка солеи изъяты. В 1931 году с храма сняли кресты и разобрали иконостас. В январе 1932 года здание передали трикотажной фабрике, чем окончательно уничтожили уникальное внутреннее убранство.
После Великой Отечественной войны в храме разместилась гидротехническая лаборатория, а с 70-х годов производство Ленбытхима.
Здание Трёхсвятительской церкви, охраняемое государством как памятник архитектуры, полностью изуродованное многочисленными переделками под производственные нужды, 15 июля 1991 года передано в ужасающем состоянии его законному владельцу - приходу Андреевского собора.
На пожертвования прихожан отремонтирован купол и восстановлены главки храма, а затем на них были воздвигнуты кресты. Воссоздан и установлен над центральным входом козырёк. Произведён реставрационный ремонт внутренних помещений, заново устроена система теплоснабжения, настелены полы, установлен иконостас со старинными и новописанными образами, приобретены большая четырёхярусная люстра и многочисленная церковная утварь.
12 февраля 1999 года, в день Трех Святителей Вселенских, возобновлены богослужения. 12 февраля 2001 года, в престольный праздник, храм освящён митрополитом Санкт-Петербургским и Ладожским Владимиром.
Выстроенная в стиле петровского барокко, Трёхсвятительская церковь является одной из первых каменных церквей города. Особенно ценно то, что вид храма за четверть тысячелетия не изменился. Однокупольное, украшенное строгими пилястрами и наличниками здание, с востока завершается большой трёхгранной апсидой и имеет два входа: западный и южный. Внутри храм поражает обширным алтарём, необычным сомкнутым центральным сводом, мощными столпами несущими крестовые своды, на которых устроены вместительные хоры. Уникальное здание церкви Трёх Святителей Вселенских не имеет аналогов в русской церковной архитектуре и в ансамбле с Андреевским собором является украшением С.-Петербурга.
В настоящее время в Трёхсвятительском храме совершаются по двунадесятым и великим праздникам ранняя литургия, нач. в 7.00; и еженедельно по четвергам литургия, нач. в 10.00, и вечерня с чтением акафиста попеременно Трём Святителям и Святителю Николаю, нач. в 17.00.
